一、质粒构建的基本流程

在刚踏入分子生物学领域时，你可能常听到师兄师姐说“这个质粒怎么又没构建成功？”质粒构建又是怎样的流程呢？本文将向大家详细介绍质粒构建步骤和外源性基因表达的全流程。

在分子生物学中，质粒是基因工程的主要元件之一，比如，敲除质粒可以辅助完成基因组上特定基因的敲除，表达质粒可以实现在宿主菌种中外源基因的表达。

质粒的构建流程示意图

1.1 选择合适的载体

载体选择是决定质粒是否可以在宿主菌中正常表达的决定性因素，载体主要组成元素为复制元件、筛选标记、多克隆位点(mcs)。复制元件用于质粒的复制；筛选标记可高效的筛选出构建完成的质粒，常用的筛选标记有抗性基因、蓝白斑筛选等；多克隆位点为目的基因插入的位置。

载体选择

1.2 获得目的基因

目的基因是质粒构建的主角，目的基因可以根据需要进行合成或者直接从现有的基因组上PCR得来。PCR得来的基因片段通常需要进行纯化才可进一步实验。这里为大家推荐信励致和的一款DNA纯化回收试剂盒。产品特点：操作简单节约时间；纯化获得的基因片段纯度高，杂质少；基因片段回收率高；纯化产物可直接用于基因测序、质粒构建等实验中。

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DNA胶回收/纯化试剂盒，100 rxns (SKU: AB0161)。

1.3 目的基因与质粒骨架的连接

质粒是否构建成功的评判标准就是目的基因是否正确的连接到载体上。常用的连接方法有酶切酶连、Gibson Assembly、Golden Gate Assembly等。这里为大家推荐信励致和的两款分子克隆试剂。产品特点：无需考虑酶切位点，基于序列同源性反应15min即可实现载体与片段的快速重组；插入片段的PCR产物正确单一，无需纯化，可直接与载体进行重组反应；可以选择性进行5min快速转化E.coli感受态细胞；C2 MultiS One Step Cloning Kit可轻松实现1~5个片段同时定向构建进入载体。

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单片段无缝克隆试剂盒，25 rxns (SKU: AB0141)，50rxns (SKU: AB0142)。

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1.4 连接产物的转化

体外完成的连接产物通常处于线性状态，所以需要将连接产物转入到感受态细胞中，使其在体内形成可正常工作的形态。常用的转化法有电转化法、化学转化法等。感受态细胞的选择可根据实验具体需求而定。这里为大家推荐信励致和的两款感受态细胞。产品特点：DH5α感受态细胞的转化效率≥10^8cfu/μg（pUC19质粒DNA），可进⾏重组质粒蓝⽩斑筛选，适合PCR产物、cDNA和⾮甲基化DNA的⾼效转化。BL21(DE3)感受态细胞的转化效率≥10^7cfu/μg（pUC19质粒DNA），其还可⽤于⾮毒性重组蛋⽩表达。

选择合适的感受态细胞

1.5 质粒的提取

质粒的提取是质粒构建的最后一步，将转入连接产物的感受态细胞进行培养，然后从中提取质粒，将提取的质粒进行测序，测序正确后即可获得质粒。这里为大家推荐信励致和的的四款质粒提取试剂盒。产品特点：质粒产物纯度佳、含量高；优化的裂解液与吸附柱组合，1小时内完成提取；添加指示剂实现操作可视化，极大提高实验效率。其中，去内毒素质粒提取系列产品提取的质粒内毒素含量极低，可保证下游细胞实验的成功进行。

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质粒小量提取试剂盒，100 rxns (SKU: AB0222)，200 rxns (SKU: AB0156)。

去内毒素质粒小量提取试剂盒，50 rxns (SKU: AB0157)。

低内毒素质粒小提中量试剂盒，50 rxns (SKU: AB0311)。

无内毒素质粒大量提取试剂盒，10 rxns (SKU: AB0159)。

二、基于质粒转化的外源基因表达

外源基因表达是基因工程的关键步骤之一，是指通过遗传操作技术，将来自于其他生物体的基因在宿主细胞中完成表达，使得宿主细胞获得新的表型及新的代谢途径或产物。实现外源基因表达常见的方式有两种，一种是将表达质粒转入宿主细胞，直接利用质粒完成表达，另外一种是通过基因工程手段，将外源基因插入到宿主细胞的基因组中。下面将以细菌作为宿主细胞，为大家详细讲述第一种，通过表达质粒的方式完成外源基因的表达。

2.1 表达质粒转入宿主菌株

表达质粒一般由载体骨架、目的基因、筛选标记、复制子、启动子、核糖体结合位点等组成，在第一章中，我们已经了解了质粒构建的基本流程。构建质粒的下一步是表达质粒，表达质粒转入细菌的方式主要有化学转化法、电转化法、接合转移等。

①化学转化法：化学转化法一般需要感受态细胞的介入，感受态细胞是指处于易于吸收外源基因状态的细胞，常用的感受态细胞制备方法为CaCl2处理法。将表达质粒和感受态细胞冰上孵育10~30min后于42℃进行热激，随后加入复苏培养基，根据菌株所需的培养条件及传代周期，进行复苏培养。将复苏后的菌液稀释涂布于筛选平板，培养后即可获得转化子。

转化子示意图

②电转化法：电转化法是指利用电场对细胞进行短暂的冲击，使细胞表面产生小孔，质粒可以通过小孔进入细胞内。电击结束后，需要立刻加入复苏培养基，辅助细胞修复因电击产生的小孔。电击的感受态细胞的制备根据菌株类型的不同有较为繁多的电击缓冲液。需要根据文献报道进行选择。

③接合转移法：接合转移法是通过细菌之间直接接触或者间接接触而完成质粒交换的过程。此方法对于质粒的选择有较高的要求，使用该方法一般需要选择穿梭质粒，此类质粒含有两种不同的复制起点和筛选标记，使其可在供体菌和受体菌株中均可正常表达。此外，穿梭质粒相较于一般质粒，其骨架上有一段穿梭蛋白，来完成质粒在不同菌株间的交换

接合转移示意图

2.2 转化后阳性克隆筛选

质粒完成转化后，需要对阳性转化子进行筛选，最为简便的方式是挑选部分转化子进行菌落PCR验证。信励致和^®2×高保真PCR预混液可直接用于菌落PCR，本产品灵敏度高、特异性好、最大扩增长度可达15kb（质粒DNA），能够对DNA片段进行高保真扩增，高效鉴定出阳性克隆。

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2×高保真PCR预混液(含染料)，1 mL (SKU: AB0113)，5 mL (SKU: AB0114)。 

2.3 基因表达鉴定

表达完成的蛋白可以通过SDS-PAGE、Western Blotting等方法进行定量或定性检测。信励致和的一步法PAGE凝胶快速配制试剂盒，无需液封、凝胶迅速，可帮助实验者快速完成PAGE凝胶的制备，制备过程中不会出现异味，制作的凝胶带有电泳示踪剂且不影响染色和转膜，检测的条带清晰，尤其对于小分子蛋白条带的分离更清晰，并且提供6%、8%、10%、12%、15%五种不同下层胶浓度的产品可选，满足不同的实验需求。

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一步法PAGE凝胶快速配制试剂盒(6%)，125 T (SKU: AC0561)。

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