在分子生物学实验中，PCR是最为常用的技术之一，PCR操作简单、检测快速，但是如此简单的实验也存在许多令人“头大”的问题，本期文章，小编将带领大家对这些问题进行逐一分析并击破。

Q1：无扩增条带

A1、引物问题：引物发生降解，建议新合成的引物放置4℃暂存，长期不使用时需置于-20℃冻存；引物设计不合理，建议在NCBI网站的Primer-Blast页面检测引物的结合位置，以判断引物设计是否与扩增目的片段正确结合。

A2、DNA聚合酶活力降低或失活：可能是因为酶的运输或保存不当导致酶出现活力降低或失活，建议重新购买新批次的酶，并将酶置于-20℃保存。

A3、PCR体系配置错误：PCR体系配置过程中加错试剂，建议重新配置反应体系进行实验。

A4、延伸时间较短：对于一些较长的基因片段，延伸时间应该延长，具体的延伸时间是多少，可根据基因的长度及所购买产品的扩增速度进行计算，在计算出的延伸时间上适当增加5s左右以保证扩增效果。

A5、模板问题：模板发生降解，建议重新制备DNA模板，模板应置于-20℃长期储存；模板杂质含量过多，基因组DNA或质粒DNA模板在提取过程中若操作不当或使用的试剂盒效果不好就会导致提取产物中有蛋白、胍盐残留从而影响后续的PCR实验。为大家推荐信励致和®去内毒素质粒小量提取试剂盒，本产品采用特制的内毒素去除试剂，得到的质粒DNA 纯度高，内毒素水平低至10 ~ 20EU/μL，提取得到的产物适用于酶切、PCR、连接、测序、转染等一系列常规生物学实验。

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RNA提取困难主要是因为RNA不稳定，极易被RNase降解，RNase普遍存在且对RNA有高度特异性。并且，RNA常与蛋白质结合，导致分离过程复杂。而对于植物样本来说，由于其细胞壁的存在，可能导致样本研磨不充分进而加大RNA提取的难度；多糖多酚类植物样本的RNA提取更是难上加难，主要因为：

1. 多糖的结构和化学特性导致其与RNA相互作用，从而使得在洗脱过程中，部分RNA与多糖紧密集合而无法有效分离。此外，在RNA的沉淀过程中，多糖也可能与RNA形成凝胶状的沉淀物，这种凝胶结构会妨碍RNA的有效提取。

2. 多酚往往会与核酸和蛋白质一起沉淀，形成不溶性的化合物。这种沉淀物会干扰核酸的提取和纯化过程，导致目标核酸的得率显著降低。

3. 多糖多酚植物样本复杂，使得提取方法需要针对不同样本进行调整。

Q2：空白对照出现条带

A1、引物特异性低：引物设计不合理，存在较多的非特异性结合，可以参照Q1中的A1进行改进。

A2、PCR体系存在污染：空白对照存在意义就是检测PCR体系是否存在污染，若空白对照出现条带，大概率就意味着PCR体系被污染，此时需要重新进行实验。

A3、电泳时存在污染：在电泳时，如果点样过多或者点样时手抖会导致空白对照的点样孔中飘进去实验组，从而出现对照有条带，但这种情况一般是空白对照的条带亮度明显弱于实验组。

Q3：非特异性扩增

非特异性扩增示意图

A1、引物特异性低：引物设计不合理，存在较多的非特异性结合，可以参照Q1中的A1进行改进；适当地提高引物的CG含量，提高Tm值，相应地提高退火温度，减少非特异性扩增。

A2、模板纯度低：模板不纯，可参考Q1中的A4进行改进。

A3、退火温度设置过低：退火温度一般设置在50~60℃，有时会根据具体的实验有所改动，但，当退火温度低于50℃时，引物的非特异性结合就会增多，从而出现杂带，建议在引物的Tm值允许的前提下适当提高退火温度。

A4、扩增循环数过多：有时为获得较多的目的基因，增加扩增循环数是最直接的方式，但是扩增不宜超过35个循环，若循环数超过35，非特异性扩增风险就会大大增加。

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Q3：胶图中出现拖尾、弥散或“笑脸”条带？

拖尾、弥散

"笑脸"条带

A1、DNA聚合酶加入量过多：酶的本质是蛋白质，反应体系中加入过多的酶会导致电泳时出现拖尾的情况，建议根据反应体系的大小及产品说明书加入适量的酶。

A2、PCR产物降解：当DNA发生降解，最直观的数据便是胶图呈现弥散条带，建议在获得PCR后的产物即可进行电泳，置于-20℃长期储存，尽量不要在常温放置。

A3、上样浓度过高：点样过多会出现“笑脸”条带，从而影响片段大小的判断，上样5 μL基本可以满足大多数的检测需求。